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研究紫草素抑制白色念珠菌的材料和方法

日期2018/11/25 15:02:33 点击次数 851 发布单位天义生物谷  录入李清

1 材料和方法


1.1 材料


1.1.1 菌种: 白色念珠菌(Candida albicans ATCC10231)购自中国医学菌种保藏中心


1.1.2 培养基与试剂: 沙堡葡萄糖琼脂固体培养基(SDA)RPM-1640液体培养基和酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YEPD)蛋黄培养基紫草素标准品?#27827;?#25104;都曼?#22266;?#32929;份有限公司


1.1.3 主要实验仪器设备: 酶标仪(Thermo MULTISKAN ASCENT)PCR仪(英国TTECHNE-512型)实时荧光定量PCR仪(日本TAKARATP800)电泳凝胶定量分析系统(Bio-Rad公司Version 3.1)扫描电镜(KYKY-1000B)激光共聚焦显微镜(Zeizz LSM 710German)


1.2 紫草素对白色念珠菌的抑制作用测定


将200 L培养至对数期的白色念珠菌的菌悬液(106 CFU/mL)分别加入96孔板中再加入20L不同浓度的紫草素药液使其终浓度分别为64321684g/mL37培养24h后于595 nm处测定吸光值以不加药物组为空白对照实验重复3次取平均值其中紫草素对白色念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)值为菌体的OD值下降80%以上的最低药物浓度从大于MIC的各孔中分别取10L菌悬?#21644;?#24067;于SDA固体培养基上37培养48h后观察菌体生长情况最低杀菌浓度(MFC)为平板上没有菌体生长的最低药物浓度


1.3 紫草素对白色念珠菌细胞膜渗?#24863;?#30340;影响


将培养至对数期的菌悬液按2%接种量接种于20mL RPM-1640液体培养基中以150r/min30恒温培养16h后离心弃上清液用PBS洗涤菌体2次制成?#23454;?#27987;度的白色念珠菌菌悬液分别向其中加入浓度为MIC和2MIC的紫草素继续培养12h每隔2h分别取样液4mL4000r/min离心10min弃沉淀用紫外分光光度计于260nm下测定上清液中DNA和RNA等大分子物质的变化以不加药为空白对照组实验重复3次取平均值


1.4 紫草素对白色念珠菌形态的影响


将培养至对数期的白色念珠菌菌悬液(107 CFU/mL)接种于含紫草素终浓度为MIC的YEPD液体培养基中150r/min30振荡培养于6h和16h分别取1mL菌悬液3000r/min离心5min后弃上清再加入0.5mL PBS缓冲液和0.5mL 2.5%的戊二醛4冰箱固定过夜次日用PBS缓冲液冲洗2次50%80%100%乙醇依次脱水1次每次15min100%乙醇浸没的电镜样?#20998;?冰箱中降温10min后放入真空干燥器中干燥40min待干燥后的样品温度升至室温后取出喷金镀膜使用扫描电镜观察照相以不加药组为空白对照实验重复3次


1.5 紫草素对白色念珠菌细胞内钙离子浓度的影响


将2mL RPM-1640培养基及300L培养至对数期的菌悬液(106CFU/mL)分别加入6孔板中每孔内分别放一片无菌盖玻片37培养4h后以加入300L浓度为MIC的紫草素的孔为实验组加入300L去离子水的孔为空白对照组37?#24405;?#32493;培养16h然后吸出每孔中的液体用PBS缓冲液洗涤2次阴干后于避光环境下向每孔中加入1mL 5mol/L的钙离子荧光探针(Fluo-3AM)于37培养箱中孵育45min进行探针装载吸出剩余的荧光探针染液并用PBS缓冲液冲洗置于37培养箱中继续孵育15min以确保Fluo-3AM完全转变为Fluo-3取出盖玻片用10L抗荧光淬灭剂进行封片后利用激光共聚焦显微镜检测荧光强度并按照公式(1)计算钙离子浓度([Ca2+])变化百分率实验重复3次




1.6 紫草素对白色念珠菌分泌胞外磷脂酶(phosphlipasePL)的影响


制备10L含紫草素终浓度为1/2MIC和MIC的菌悬液(106 CFU/mL)并用移液枪接种于卵黄培养基上以加等量PBS的菌悬液为空白对照于37下培养48h待培养结束后用刻度尺分别测?#31185;?#26495;上的菌落?#26412;?#21644;沉淀圈?#26412;?#27599;组实验重复3次取平均值磷脂酶的活性用PZ值表示PZ?#34507;?#19979;列公式计算PZ值=菌落?#26412;?总?#26412;?#24635;?#26412;?菌落?#26412;?菌落周围沉淀圈的?#26412;PZ=1表示无磷脂酶活性PZ值<1表示有磷脂酶活性且PZ值越大磷脂酶的活性越弱


1.7 紫草素对白色念珠菌PLB1和PLB2相对表达量的影响


1.7.1 白色念珠菌PLB1和PLB2基因的检测: 提取模板DNA根据GenBank中已发布的白色念珠菌的基因序列利用Primer 5.0软件及参考?#21335;?#35774;计磷脂酶相关基因PLB1和PLB2的上下?#25105;?#29289;琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物PCR扩增条件为94 5min94 30s55 30s72 45s30个循环72 10min


1.7.2 紫草素对白色念珠菌PLB1和PLB2相对表达量的影响: 将培养至对数期的菌悬液接种?#33014;?#32043;草素终浓度分别为1/8 MIC1/4 MIC和1/2 MIC的RPM-1640培养基中30桢150 r/min培养16h后采用Trizol法提取RNA用微量核酸测量仪进行RNA浓度的定量采用2步法反转合成模板cDNA根据设计合成RT-PCR引物进行扩增以18SrRNA为内参基因以不加药物组为空白对照待?#20174;?#32467;束后分析RT-PCR的扩增曲线和融解曲线并计算PLB1和PLB2基因的相对表达量


1.8 统计学方法


采用SPSS 17.0及Curve Expert 1.3统计软件进行分析数值用均数标准差(xs)表示予以卡方检验和t检验以P<0.05为具有统计学意义

 
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