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脂环酸芽孢杆菌抗原制备

日期2018/3/26 11:52:02 点击?#38382;?nbsp;1639 发布单位天义生物谷  录入李清

摘要采用已建立的间接 ELISA 法分别测定 3F7 和 9C4 各吸收峰的纯化产物并与纯化前的腹水50%饱 和(NH4)2SO4 沉淀和 45%饱 和 (NH4)2SO4 沉淀的蛋白效价进行比较将纯化后腹水中 McAb 进行亲和常数的测定

免疫用抗原制备参考?#21335;?#30340;方法培养 A. acidoterrestris (ATCC49025)重复洗涤 2 次后用生理盐水将该菌的浓度调整到 109 CFU/mL

包被用抗原制备取部分洗脱好的菌液用超声波粉碎仪进行裂解以 20 kHz 频率150 W 的功率在冰浴中将细菌细胞破碎每 6 s 间隔 4 s总共时间为 30 min裂解后将液体 3 000 r/min 离心 10 min将上清与沉淀分别用 Eppendorf 管进行分装存于−20 C

?#31174;?#26041;法采用间接 ELISA用方阵滴度法确定抗原包被浓度和酶稀释度抗原分别做 1:1 000 1:2 0001:4 000 ?#21335;?#37322;酶标分别做 1:20 000 1:40 000 ?#21335;?#37322;免疫小鼠多抗血清用样品稀释液从 40起倍比稀释HRP 标记的羊抗小鼠 IgG用酶稀释液分别做 1:20 0001:40 000 稀释设阴性和空白对照以 450 nm 波长以空白对照调零读记各孔光密度值(OD)凡P/N>2为阳性结果(P/N= 待测孔 OD 值/阴性对照孔 OD 值)

取 5 只 6−8 周龄体重 18 g 左右雌性的健康 BALB/c 小鼠免疫前 7 天卡介苗致敏小鼠 (0.1 mL/每只)每次免疫间隔 3 周都较前一次免疫剂量加倍共 3 次于第 3 次免疫 7 d 后以间接ELISA 法检测小鼠抗体效价取效价最高的小鼠脾脏进行细胞融合确定的抗原包被浓度包被酶标板将免疫小鼠全血按照 100200 400−51 200?#26009;?#37322;即倍比稀释的方法进行间接 ELISA 法检测

对冻存的骨髓瘤细胞(SP2/0)进行复苏用含 20%胎牛血清的 DMEM 完全培养液进行传代培养且加入 1% 8-氮鸟嘌呤进行处理细胞处于对数生长期时?#32431;?#29992;于细胞融合制?#26438;?#20859;层细胞免疫鼠脾细胞悬液与骨髓瘤细胞进行细胞融合

?#27604;?#21512;细胞覆盖孔底 20%−30%时用间接 ELISA 法对细胞培养上清进行检测对挑选出的阳性孔及时采用有限稀释法进行克隆每次克隆后第 9 天左右对克隆过?#21335;?#32990;上清用 ELISA 进行检测对所得的 OD450和对应的克隆数进行评价选择克隆数少OD450 高的阳性孔将其再次克隆经 3−4 次克隆直到阳性率 100%将细胞株转入 24 孔细胞培养板中继续生长待其适应后再转入细胞瓶中细胞数?#23380;?#22815;多时收集细胞进行小鼠腹水的制备

取 8−10 周龄 BALB/c 小鼠每只小鼠腹腔注射 0.5 mL高压灭菌后的液体石蜡7 d 后腹腔注入 1106 −5106 个杂交瘤细胞小鼠腹部明显膨大时无菌操作收集腹水1 000 r/min 离心10 min 收集中间层液体?#27425;?#21333;克隆抗体−20 C 冻存备用离心沉淀物用生理盐水悬浮后按 1106 −5106 个细胞/只注射小鼠继续进行腹水的扩大化生产将传代过程中生长良好?#21335;?#32990;移入2 mL冻存管于液氮罐中冻存

用间接 ELISA 方法对单克隆抗体细胞培养液上清和腹水进行效价测定亚类鉴定采用 Sigma 公司的免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒进行鉴定杂交瘤细胞的染色体鉴定按照?#21335;?#36827;?#23567;?#27979;定杂交瘤细胞在第1次?#38477;?次克隆的 OD450同时测定小鼠第 1 234 代腹水的效价并将这些结果进行比较

用 ELISA 叠加试验进行抗原位点分析(腹水和细胞上清)在确定各 McAb 饱和值的基础上在最适菌体抗原包被的酶标板内分别加入一种饱?#22242;?#24230; McAb1 (100 L/孔)37 C 作用 30 min洗涤 4 次后加入另一种饱?#22242;?#24230;的 McAb2 (100 L/孔)同样孵育洗涤加入 1:1 000 稀释的羊抗小鼠 IgG-HRP (50 L/孔)同样孵育洗涤加入 TMB 底物溶液(100 L/孔)显色 10 min2 mol/L H2SO4 终止?#20174;?#27979;定 OD450 值计算叠加率(AI)按如下公式计算AI=[2A(1+2)(A1+A2)−1]100%公式中 A1为 McAb1 的 OD450值A2为 McAb2 的 OD450值 A(1+2)为 McAb1 叠加 McAb2 的 OD450值AI >50% 说明被测的两株单抗的抗原结合位点不同AI<50% 说明被测的两株单抗抗原结合位点相同且 AI 值越大抗原位点重叠的可能性越小

 
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